กล้องคอนโฟคอล

กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล (อังกฤษ: Confocal microscope ; Confocal microscopy) เป็นกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้เทคนิคทางแสงบริเวณจุดโฟกัส (focal point) ในการถ่ายภาพเพื่อเพิ่มความละเอียด (resolution) และความคมชัด (contrast) ของภาพถ่าย โดยใช้แหล่งกำเนิดแสงแบบจุดและรูขนาดเล็กเพื่อกำจัดแสงบริเวณนอกจุดโฟกัส ซึ่งเทคนิคการถ่ายภาพลักษณะนี้สามารถสร้างภาพของโครงสร้างในรูปแบบสามมิติได้ โดยใช้ภาพจากระนาบโฟกัสต่างๆ มาประกอบกัน เทคนิคนี้ได้รับความนิยมในวงการวิทยาศาสตร์และอุตสาหกรรม โดยทั่วไปกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล ถูกใช้งานอยู่ในวงการวิทยาศาสตร์สำหรับสิงมีชีวิต, ชีววิทยา , วิทยาศาสตร์สำหรับสารกึ่งตัวนำ, และวัสดุศาสตร์

หลักการทำงานของกล้องคอนโฟคอล

หลักการพื้นฐาน

 

ภาพหลักการทำงานของการถ่ายภาพแบบคอนโฟคอลที่ได้รับการจดสิทธิบัตรเมื่อปี ค.ศ. 1957 โดย มาวิน มินสกี้

หลักการทำงานของการถ่ายภาพแบบคอนโฟคอลนั้นได้รับการจดสิทธิบัตรเมื่อปี ค.ศ. 1957 โดย มาวิน มินสกี้ (Marvin Minsky) การถ่ายภาพแบบคอนโฟคอลนี้มีจุดประสงค์เพื่อแก้ไขปัญหาข้อจำกัดต่างๆของกล้องจุลทรรศน์แสงฟลูออเรสเซ็นต์แบบมุมมองกว้าง (wide-field fluorescence microscope) ซึ่งเป็นแบบดั้งเดิม โดยกล้องจุลทรรศน์แสงฟลูออเรสเซ็นต์แบบมุมมองกว้างนั้นจะใช้แสงฟลูออเรสเซ็นต์ความยาวคลื่นหนึ่งส่องไปบนทุกส่วนของชิ้นเนื้อตัวอย่าง และชิ้นเนื้อตัวอย่างนั้นจะสะท้อนแสงฟลูออเรสเซ็นอีกความยาวคลื่นหนึ่งมายังตัวรับแสง (photodetector) ดังนั้นตัวรับแสงจะรับแสงฟลูออเรสเซ็นที่สะท้อนมาทั้งหมด ซึ่งรวมถึงแสงที่ไม่ได้อยู่ที่จุดโฟกัส ในทางตรงกันข้ามกันกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลใช้แหล่งกำเนิดแสงฟลูออเรสเซ็นแบบจุด (เกี่ยวข้องกับ Point Spread Function) และใช้เลนส์โฟกัสแสงไปบนชิ้นเนื้อตัวอย่างและรับแสงสะท้อนจากชิ้นเนื้อตัวอย่างมาผ่านรูขนาดเล็กเพื่อกำจัดแสงที่ไม่ได้อยู่บริเวณจุดโฟกัสก่อนที่แสงจะไปสู่ตัวรับแสง ดังนั้นจะมีแสงที่จุดโฟกัสเท่านั้นที่นำมาสร้างเป็นสัญญาณภาพ ด้วยเหตุนี้เองภาพที่ได้จึงมีความละเอียดสูงขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งความละเอียดของภาพทางด้านความลึก เนื่องจากแสงจากบริเวณที่ตื้นหรือลึกกว่าจุดโฟกัสจะถูกกำจัดโดยรูขนาดเล็กก่อนที่จะมาถึงตัวรับแสง แต่ถึงอย่างไรการใช้รูขนาดเล็กในการจำกัดแสงที่รับเข้ามาจะทำให้ภาพมีความเข้มของแสงลดลงตามไปด้วย ดังนั้นในการใช้กล้องคอนโฟคอลจึงจำเป็นต้องเพิ่มเวลาในการเปิดหน้ากล้องให้นานขึ้น เมื่อการรับแสงเป็นการรับแสงแบบทีละจุดจากจุดโฟกัส ดังนั้นการที่จะได้ภาพ 2 มิติ จำเป็นต้องทำการสแกนการรับภาพทางแนวราบทั้งชิ้นเนื้อตัวอย่างชิ้นเนื้อแล้วนำมาประกอบกันเป็นภาพ 2 มิติที่สมบูรณ์ ในทำนองเดียวกันถ้าต้องการสร้างภาพ 3 มิติ จำเป็นต้องมีการสแกนการรับภาพทั้งทางแนวราบและแนวดิ่ง หลังจากนั้นนำข้อมูลมาสร้างเป็นภาพ 3 มิติ ที่สมบูรณ์ ความละเอียดทางด้านความลึกของจุดโฟกัสของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล หมายถึง ความหนาของบริเวณที่กล้องคอนโฟคอลยอมให้แสงผ่านเข้าไปยังตัวรับแสง ค่านี้ส่วนมากจะถูกกำหนดโดยผลลัพธ์ของความยาวคลื่นแสงหารด้วยค่าของรูรับแสงของเลนวัตถุ (Numerical Aperture, N.A.) ของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลยกกำลังสองและคุณสมบัติทางแสงของชิ้นเนื้อ จากที่กล่าวมาการจำกัดแสงสะท้อนทางด้านความลึกของชิ้นเนื้อทำให้เราสามารถสร้างภาพ 3 มิติ โดยการเลื่อนจุดโฟกัสไปยังตำแหน่งต่างๆทั้งทางด้านแนวราบและแนวดิ่งนั่นเอง

เทคนิคที่ใช้ในการสแกนในแนวราบของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล

มีกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลอยู่ 3 ชนิดที่มีอยู่ในท้องตลาดปัจจุบัน

• กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน (อังกฤษ: Confocal laser scanning microscpoes) กล้องชนิดนี้ใช้กระจก (โดยทั่วไป 2-3 ชิ้น) สแกนลำแสงเลเซอร์แบบเชิงเส้นทั้งในแกน x และแกน y ให้ทั่วทั้งชิ้นเนื้อตัวอย่าง โดยที่รูขนาดเล็ก (pinhole) และตัวรับแสง (photodetector) ไม่เคลื่อนที่
• กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดจานหมุน (จานนิพโค) (อังกฤษ: Spinning-disk (Nipkow disk) confocal microscope) ใช้ชุดจานหมุนซึ่งมีรูขนาดเล็ก (pinhole) จำนวนมากในแผ่นจานในการสแกนลำแสงให้ทั่วทั้งชิ้นเนื้อตัวอย่าง ในขณะที่แผ่นจานนั้นหมุน
• กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดอาเรย์ที่สามารถโปรแกรมได้ (อังกฤษ: Programmable Array Microscopes ; PAM) เป็นการใช้สัญญาณอเล็คทรอนิคส์ควบคุมอุปกรณ์สำหรับปรับแต่งลำแสง (Spatial Light Modulator (SLM)) ซึ่งอุกรณ์นี้ทำหน้าที่เสมือนรูขนาดเล็กจำนวนมากที่สามารถเคลื่อนที่ได้ โดยอุปกรณ์ปรับแต่งลำแสงนี้ประกอบด้วยกระจกขนาดเล็กจำนวนมาก (microelectromechanical mirrors) ที่วางเรียงกันในรูปแบบตาราง โดยที่กระจกขนาดเล็กนี้สามารถปรับการหมุนและการสะท้อนด้วยสัญญาณทางไฟฟ้า กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดนี้ใช้ CCD เป็นตัวรับสัญญาณแสง

กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลแต่ละชนิดมีข้อดีข้อเสียแตกต่างกันไป โดยที่ระบบของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลทุกชนิดพยายามปรับแต่งให้ระบบมีความเหมาะสมทั้งในด้านความเร็วในการบันทึกภาพและความละเอียดของภาพ โดยที่กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนนั้นสามารถปรับแต่งความถี่ในการเก็บสัญญาณภาพและความละเอียดในการเก็บสัญญาณภาพ ในขณะที่กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดจานหมุน (จานนิพโค) และกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดอาเรย์ที่สามารถโปรแกรมได้มีความถี่ในการเก็บสัญญาณภาพและความละเอียดในการเก็บสัญญาณภาพคงที่ แต่มีความเร็วในการเก็บสัญญาณภาพสูงกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน ขณะนี้ในท้องตลาดนั้นกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดจานหมุน (จานนิพโค) สามารถเก็บภาพด้วยความเร็วมากกว่า 50 ภาพต่อวินาที ซึ่งความเร็วดังกล่าวเป็นที่ต้องการเมื่อต้องการจับภาพความเคลื่อนไหวของเซลล์สิ่งมีชีวิตขณะมีชีวิตอยู่

การพัฒนาที่สำคัญที่เป็นจุดเปลี่ยนที่สำคัญของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนที่ทำให้ความเร็วในการเก็บภาพสูงขึ้นได้มากกว่ามาตรฐานวีดีโอ (60 ภาพต่อวินาที) โดยการนำเอากระจกขนาดเล็กมาใช้ในการสแกนลำแสงเลเซอร์ซึ่งกระจกขนาดเล็กนี้เป็นผลของการพัฒนาของระบบไฟฟ้าเครื่องกลจุลภาค (อังกฤษ: Microelectromechanical Systems ; MEMS)

การเอ็กซ์เรย์โดยใช้เทคนิคและหลักการเดียวกันกับการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลโดยใช้แสงฟลูออเรสเซ็นต์ เป็นเทคนิคใหม่ที่สามารถควบคุมความลึกของการเอ็กเรย์ได้ ตัวอย่างการใช้งานของการเอ็กเรย์ด้วยเทคนิคใหม่นี้คือการหาชั้นของพื้นผิวที่ถูกเขียนทับ ภายใต้ภาพเขียน

ภาพที่ได้จากกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล

•  

  β-tubulin ใน Tetrahymena
•  

  พื้นผิวของเหรียญ 1 ยูโร ที่ได้จาก กล้องคอนโฟคอล (จานนิพโค)
•  

  ข้อมูลที่ได้จากกล้องคอนโฟคอลของเหรียญ 1 ยูโร
•  

  ภาพตัดขวางของรูปก่อนหน้านี้ตรงพิกัด y=200

อ้างอิง

1. Pawley JB (editor) (2006). Handbook of Biological Confocal Microscopy (3rd ed.). Berlin: Springer. ISBN 0-387-25921-X.
2. Filed in 1957 and granted 1961. US 3013467
3. Memoir on Inventing the Confocal Scanning Microscope, Scanning 10 (1988), pp128–138.
4. "Data Sheet of NanoFocus μsurf spinning disk confocal white light microscope" (pdf).
5. Vincze L (2005) "Confocal X-ray Fluorescence Imaging and XRF Tomography for Three Dimensional Trace Element Microanalysis". Microscopy and Microanalysis 11 (Supplement 2). doi:10.1017/S1431927605503167.

แหล่งข้อมูลอื่น

• Molecular Expressions: Laser Scanning Confocal Microscopy
• Emory’s Physics Department. Introduction to confocal microscopy and fluorescence.
• The Science Creative Quarterly's overview of confocal microscopy - high res images also available.
• Programmable Array Microscope - Confocal Microscope Capabilities.
• Introduction to Confocal Microscopy (video) by Kurt Thorn (UCSF)